Fernando Paolicchi
Investigador INTA – Profesor Adjunto
Laboratorio de Bacteriología, Grupo Sanidad Animal
EEA INTA Balcarce - Facultad de Ciencias Agrarias UNMdP
La Tuberculosis bovina (TBC) es una enfermedad infecciosa causada por Mycobacterium bovis, caracterizada por la formación de granulomas conocidos como tubérculos. Conjuntamente con M. tuberculosis, M. africanum, M. canettii, M. microti, M. bovis BCG, y otras variantes de M. bovis como M. caprae y M. pinnipedii, integran el Complejo Mycobacterium tuberculosis. El ganado bovino es considerado el reservorio principal (húesped primario) de M. bovis, y ha sido aislado en diversas especies domésticas y salvajes como así también desde humanos, por ende la enfermedad es clasificada como zoonosis. Los animales infectados son la principal fuente de infección y entre las categorías de adultos, la vía más frecuente es la aerógena. Los sistemas de producción intensivos, contrariamente a los extensivos, facilitan el contacto directo de los animales y favorecen la propagación de la TBC. El porcentaje de vacas infectadas que excretan M. bovis por leche oscila entre 1-2% y la ingestión de leche contaminada por el bacilo e ingerida por terneros es una forma frecuente de infección y diseminación dentro del rodeo.
La TBC es aun considerada en algunas regiones un riesgo para la salud pública, debido al consumo de leche cruda contaminada. Sin embargo, actualmente, los humanos que contraen infección por M. bovis lo hacen principalmente por vía respiratoria a través de la inhalación de micro gotas infecciosas. En los países desarrollados los programas de erradicación han reducido significativamente la prevalencia de esta enfermedad, pero la presencia de reservorios en las poblaciones de animales salvajes puede actuar como fuente de re-infección de mamíferos domésticos dificultando la erradicación. En países donde se ha controlado la infección en animales domésticos la presencia de animales salvajes impide la completa erradicación de la enfermedad, como ocurre en Gran Bretaña donde a pesar de un estricto plan de control, la transmisión de tuberculosis se produce a través de los roedores de vida salvaje (Badgers). En Argentina hemos estudiado la presencia de TBC en diferentes animales salvajes que cohabitan rodeos bovinos lecheros con la enfermedad, aislando en muchos casos cepas variadas de M. bovis demostrando así la relación con las infecciones recurrentes en rodeos lecheros.
Los datos de prevalencia de la enfermedad en la Argentina, se obtienen en base a la realización de las pruebas tuberculínicas y a la detección de los animales con lesiones compatibles con TBC, evaluada por la observación macroscópica de los animales faenados en los frigoríficos y mataderos con inspección federal. El Plan Nacional de Control y Erradicación de la TBC en vigencia a partir del año 1998, tuvo como objetivo principal la erradicación de la enfermedad en los tambos de las cuencas lecheras en combinación con las usinas pasteurizadoras, recibiendo apoyo de las Facultades de Veterinaria con cursos de acreditación dirigidos a los veterinarios de la actividad privada. Actualmente se encuentra vigente el Plan de Control recientemente aprobado mediante la Reglamentación Nro 128/2012 del SENASA (www.senasa.gov.ar), que incorpora algunas modificaciones a las descriptas anteriormente, se basa en la cooperación entre los servicios de salud animal y otras organizaciones, aunque no ofrece la alternativa de una compensación económica por la eliminación de los reactores positivos a TBC. El número de rodeos oficialmente libres de TBC en el período 1995-2006 reportados por SENASA fue de 6.739 establecimientos certificados, donde el 90% de los animales correspondieron a bovinos lecheros de las cuencas lecheras de las Provincias de Buenos Aires, Córdoba, Entre Ríos, La Pampa y Santa Fe, llegando a 1.8 millones de cabezas bovinas certificadas libres de infección. El total de los establecimientos oficialmente libres de TBC al mes de diciembre del año 2011, corresponden a 6.948, mientras que el número de bovinos certificados en los establecimientos oficialmente libres es de 2.322.871, correspondiendo 2.091.819 a ganado lechero, 193.573 a ganado de carne y 37.479 a ganado de leche y carne.
Para el diagnóstico de TBC la técnica diagnóstica oficialmente utilizada en nuestro país es la intradermorreacción con tuberculina. Esta prueba detecta inmunidad celular mediante una reacción de hipersensibilidad de tipo retardado. Esta reacción tiene lugar localmente después de la inyección intradérmica de la tuberculina y se mide a las 72 horas de realizada la misma. La tuberculina o PPD “derivado proteico purificado” es una preparación que consiste en proteínas liberadas al medio de un cultivo de M. bovis. El uso de la PPD puede presentar reactores falsos positivos. La relativa especificidad de la PPD, se debe a la aparición de reacciones cruzadas inespecíficas por sensibilización de los animales con otras micobacterias patógenas o no patógenas ambientales. La posibilidad de aparición de falsos negativos ha sido descripta asociado a desensibilización post-tuberculinización hasta los 56 días de la aplicación de tuberculina, anergia en estados de enfermedad severos o generalizados por TBC u otras enfermedades, stress debido a malnutrición, lactancia y a gestación. Debido a esto, aplicando sólo PPD podrían quedar sin identificar en los rodeos, animales en estados avanzados de la enfermedad y por lo tanto eliminadores del bacilo. Otras causas como el uso de tuberculinas de baja potencia, vencidas o mal conservadas, incorrecta lectura, incorrecta dosificación y aplicación, son todos factores que atentan contra el diagnostico e interpretación de la intradermorreacción. Las investigaciones en el campo del diagnóstico se han focalizado hacia el mejoramiento de este método diagnóstico a través del estudio de nuevos antígenos “candidatos” que reemplacen con éxito a la PPD. De esta forma seria importante la utilización durante el saneamiento de un rodeo, de otros métodos de diagnóstico aplicados en forma complementaria con la PPD o con pruebas intradérmicas que utilicen antígenos específicos de M. bovis seleccionados.
Otro método utilizado para el diagnóstico de TBC es el dosaje de gamma interferón en sangre. En esta técnica se cuantifica la liberación de gamma interferón, por parte de los linfocitos sensibilizados tras su estimulación con antígenos de M. bovis, midiendo de la misma forma que la tuberculina la inmunidad celular frente al bacilo. La prueba consta de dos pasos, primero las muestras de sangre son enviadas al laboratorio dentro de las 24 horas de la toma de la misma, y luego son cultivadas a 37°C en presencia de tuberculina bovina y aviar, preferentemente sin agregado de fenol. Luego de 24 horas de incubación, el plasma sobrenadante se recolecta y se cuantifica la cantidad de gamma interferón liberado por un inmunoensayo utilizando un kit comercial. Se interpreta como positivo cuando las células sanguíneas del animal producen más gamma interferón luego de la estimulación con tuberculina bovina que con la tuberculina aviar y el control sin estimular. Generalmente se considera que el gamma interferón es más sensible que la prueba de la tuberculina, porque además cuenta con un sistema de corte que permite ajustarlo a las condiciones locales. El mayor beneficio es trabajar con las dos técnicas aparejadas en rodeos de alta prevalencia o con infección persistente, donde trabajar solo con la prueba de la tuberculina podría aumentar el tiempo de eliminación de positivos. Esto aumentaría la sensibilidad del diagnóstico y por ende un mayor y más rápido control de la enfermedad. Un estudio reciente demostró que animales positivos a gamma interferón y negativos a la prueba de PPD, tenían de 7 a 9 veces más probabilidad de dar positivo a una próxima prueba de PPD que los gamma interferón negativos. En el Laboratorio de Bacteriología INTA Balcarce hemos procesado mas de 4000 animales por la prueba de gamma interferón obteniendo resultados altamente concordantes con los de tuberculina, pero además animales gamma interferón positivos provenientes de rodeos con alta prevalencia y que previamente resultaran negativos a la PPD.
También la prueba de ELISA fue ampliamente ensayada con sueros para el diagnóstico de TBC en bovinos usando como antígeno el PPD. Los valores de especificidad y sensibilidad han resultado menos concordantes que con gamma interferón posiblemente por la variabilidad en las poblaciones estudiadas. Sin embargo los anticuerpos pueden ser de importancia diagnostica en animales que no presentan inmunidad celular detectable y resultan negativos a PPD, por ende el estudio del suero en rodeos tuberculosis podría dar resultados complementarios a los del uso de la tuberculina, detectando animales infectados y negativos a tuberculina.
Los resultados de estas pruebas indirectas preferiblemente deberían ser confirmados con los resultados de estudios bacteriológicos, principalmente el cultivo para el aislamiento de M. bovis y consecuentemente la caracterización molecular de las cepas aisladas. Estos métodos bacteriológicos tradicionales de cultivo son lentos, requiriendo de 3 a 8 semanas a partir del animal post mortem. Muestras obtenidas de animales vivos tales como muestras de leches, hisopados nasales profundos han resultado difíciles para el aislamiento e identificación de M. bovis, por el bajo número de bacilos que se eliminan y por la destrucción del mismo con los métodos drásticos que se utilizan para decontaminar la muestra previamente al cultivo.
Las pruebas moleculares como las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos (PCR), han sido aplicadas para el diagnóstico de TBC humana y bovina. La más popular de estas técnicas es la denominada PCR. Las secuencias de inserción repetidas en el ADN bacteriano son IS6110 e IS1081, las más conocidas para aplicar como blanco en las reacciones de PCR. Esta reacción permite acortar el tiempo de diagnóstico en cultivo de 2 meses a 4-6 días y alcanza gran sensibilidad. Otra ventaja del uso de PCR en diagnóstico es su especificidad, ya que los materiales (oligonucleótidos) que se emplean para amplificar los trozos de ADN de M. bovis son específicos del genoma del organismo patógeno. La técnica de PCR cuenta con la ventaja adicional de su rapidez y sensibilidad, y una vez estabilizada para las muestras de campo podría ser aplicada sobre diferentes muestras clínicas tales como leche, sangre, hisopados faríngeos, biopsias, semen, pero principalmente tejidos con lesiones granulomatosas y cepas aisladas.
Actualmente se están estudiando técnicas de diagnóstico serológico rápido de la TBC para detectar en forma temprana animales infectados. Estas nuevas pruebas se basan en la detección de antígenos secretados por la micobacteria en la sangre del animal. Los métodos serológicos como el ELISA que utilizan antígenos recombinantes específicos de M. bovis se basan en la detección de anticuerpos IgG contra proteínas y contra el lipopolisacárido LAM de la pared de la micobacteria. Existen algunos test comerciales que detectan en suero anticuerpos IgG a otros antígenos (Rv3425, 38 KDa y LAM). La técnica denominada MAPIA está basada en la inmovilización de una serie de antígenos pegados a una membrana de nitrocelulosa que es seguida por el desarrollo de una técnica inmunocromógena que detecta la presencia de anticuerpos IgG en suero. La ventaja de esta técnica radica en que la lectura se hace visualmente, sin requerimiento de equipos y por una persona que no requiere gran entrenamiento. La desventaja actual es su baja sensibilidad y especificidad, pero en los últimos estudios se han incrementado las mismas usando una combinación de antígenos de M. bovis.
Otros métodos de detección son los basados en la detección de antígenos circulantes de las micobacterias con valor diagnóstico sin la desventaja que presenta la detección de anticuerpos. Se comenzó a prestar especial atención al LAM, componente específico de la pared de la micobacteria, que cuando esta presente en el animal infectado se libera en la sangre, es inmunogénica, un factor de virulencia y por lo tanto un potencial antígeno para su empleo en diagnóstico. Este nuevo método desarrollado por investigadores de INTA se ha denominado MADA y utiliza suero del animal para detectar antígenos secretados por el bacilo de la TBC cuando esta presente en animales infectados, sean antígenos de infección temprana o de latencia de la enfermedad.
La epidemiología molecular en microbiología de micobacterias se enriqueció con la utilización de técnicas de biología molecular, orientadas a la tipificación de los microorganismos en base a sus características genéticas. Contempla estudios con distintos enfoques, entre ellos se destacan la identificación de la distribución de los microorganismos, la vigilancia epidemiológica de las enfermedades infecciosas y la evolución que toman a través de los años. La genotipificación de aislamientos de M. bovis, fue ampliamente utilizada en estudios de brotes epidémicos y de diversidad de cepas en Argentina, como herramienta en estudios de transmisión dinámica y otros aspectos de la epidemiología de la TBC. Mediante estudios poblacionales, es posible vigilar el curso de las campañas de control de TBC, pudiendo detectar los cambios en la heterogeneidad de los patrones de los aislamientos estudiados y el comportamiento de la enfermedad. Entre las técnicas más aplicadas se encuentra el polimorfismo en longitud de los fragmentos de restricción (RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism). Como vector de identificación se usa la secuencia de inserción IS6110 del bacilo, pero esta técnica requiere gran cantidad de ADN purificado y demora varias semanas debido al cultivo previo. Entre las técnicas basadas en PCR y que permiten la diferenciación del complejo M. tuberculosis, se destacan el Spoligotyping (Spacer oligo typing) y los VNTRs (Variable Number Tandem Repeat). El Spoligotyping es una técnica de hibridación reversa, que detecta el polimorfismo de una región específica del genoma de las micobacterias que forman parte del complejo Mycobacterium tuberculosis y por ende de M. bovis.
A pesar de existir en Argentina herramientas de diagnóstico de la TBC bovina con posibilidad de uso y de desarrollo a futuro tales como las nombradas anteriormente, otra herramienta que se debe tener presente para utilizar en etapas de saneamiento y control de la enfermedad, son las que cada veterinario responsable sanitario posee bajo su ambito profesional, esto es, un firme criterio adoptado frente a cada nueva o reiterada situacion epidemiologica de la TBC. La tuberculina es una prueba diagnóstica que se debe manejar con sumo cuidado para evitar malas interpretaciones a la hora de la lectura. La higiene correcta de los elementos a usar y del sitio de aplicación, el uso de elementos adecuados en la manga y por sobre todo paciencia en el momento de la lectura e interpretación. La toma de desiciones de importancia a la hora de separar un animal del rodeo y de su rápida venta a faena depende del responsable sanitario, que es quien emite el certificado y lo firma ante las autoridades sanitarias y las usinas lácteas. Cuando las situaciones lo ameriten, el uso de otras técnicas alternativas es totalmente licito, el seguimiento de los animales a faena o la necropsia a campo y la correcta identificación de lesiones en cada animal positivo es fundamental, mientras que el aislamiento de cepas de micobacterias por laboratorios experimentados da una idea muy aproximada de los resultados de la aplicación de tuberculina u otros metodos diagnósticos usados. Pero dependerá de cual es la situacion epidemiologica previa y la prevalencia encontrada en cada rodeo, ya que estos factores deben orientarnos a tener en cuenta los factores de riesgo presentes en el establecimiento. Los factores de riesgo mas importantes son la alimentación de terneros con leches infectadas, el tiempo del desmadre, los movimientos internos de ganado y las nuevas incorporaciones de animales provenientes de rodeos no propios, la situación sanitaria de cada región y de la “vecindad”, la presencia de fauna salvaje, entre los mas importantes. Esta compleja situación hace que el episistema en TBC sea determinado por las interacciones entre el huésped, el ambiente y el patógeno. Por ejemplo, conocemos en Argentina si todas las cepas de M. bovis que circulan son idénticas en su patogenicidad o virulencia?, sabemos si las cepas de campo son idénticas o diferentes a la cepa que se utiliza como patrón para hacer la tuberculina? Sabemos cuántos y cuáles son los animales salvajes que contribuyen a las coinfecciones o reinfecciones en los rodeos? Cuales son las pruebas alternativas a la intradermoreaccion que pueden utilizarse para certificar rodeos libres? Cuantos laboratorios hay en Argentina capaces de dar apoyo a los veterinarios de campo y a los frigorificos en este tema?
Algunas de estas dudas deberían ser analizadas y abordadas por todas las instituciones sanitarias y la adopción del nuevo Plan de Control de la TBC en el país debería ser discutido en el contexto de cada región o provincia (COPROSA?) para evaluar la posibilidad de aplicación de un “plan superador” que amplie las espectativas de los resultados futuros y el uso de metodologías complementarias de campo y laboratorio para mejorar el diagnóstico. En Argentina no tenemos una buena red de laboratorios que realicen cultivos y diagnosticos por pruebas de laboratorio de TBC en la Argentina, pero si tenemos una red consolidada de laboratorios de diagnostico veterinario con la capacidad para el procesamiento de muestras, entonces es una buena oportunidad para ir creando estas redes conjuntamente con el desarrollo de nuevos métodos y pruebas que complementen los hallazgos de campo y frigorifico.
Todos los actores del sistema sanitario en el país somos responsables y ninguna de las acciones aplicadas por sí sola dará el resultado esperado sino las acompañamos con acciones complementarias de manejo, de diagnostico y de toma de desiciones. Los veterinarios y productores estan en condiciones de solicitar el apoyo necesario en el tema TBC, mientras que las instituciones de control sanitario, de investigación y de enseñanza se encuentran en este momento intercomunicadas por acciones concretas en el area del diagnóstico de laboratorio y de campo, en temas relacionados a aspectos epidemiologicos y de difusión. Una nueva vacuna contra la TBC bovina podría ser el futuro, pero en la actualidad se requieren acciones rápidas y concretas con el compromiso de todos los sectores. La tarea no sera fácil en este país, porque tampoco lo es en otros países desarrollados y deberemos ver el futuro auspicioso basado en nuestro compromiso desde cada lugar de trabajo sea privado u oficial.